Введение дигидрокверцетина (ДКВ) в сахаристые кондитерские изделия на жировой основе способствует стабилизации липидов, что проявляется в улучшении качества и увеличении сроков хранения. С другой стороны представляет интерес использование таких стабилизирующих продуктов в качестве вводимого в организм депо антиоксидантов. Такой способ введения антиоксидантов может способствовать поддержанию определенного уровня ингибиторов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в организме человека, достаточного для торможения свободнорадикальных процессов, активация которых наблюдается при возникновении и развитии широкого круга патологических состояний и при воздействии внешних неблагоприятных факторов.

ДКВ является оригинальным отечественным лекарственным средством, обладающим антиоксидантными, капилляропротекторными, противовоспалительными и антигистаминными свойствами и проявляющим радиозащитный эффект.

Цель настоящей работы заключалась в оценке антиокислительного действия ДКВ, вводимого в биологическую модель или животным в составе липидной фракции кондитерской массы.

Объектами исследования служили липидные фракции кондитерских изделий (ЛК) рецептур I и II с различным содержанием ДКВ. Предварительно было установлено, что ЛК, извлеченные из кондитерских масс совместно с ДКВ, являются репрезентативной моделью самих кондитерских изделий. О скорости ПОЛ в печени животных и антиокислительном действии ЛК кондитерских изделий судили по количеству образующе­гося продукта ПОЛ - малоновому диальде-гиду (МДА), определяемого по методике.

Для выявления антиокислительной актив­ности ЛК использовали два пути. Один был моделированием патологического в условиях invitro, другой - в invivo при внутрижелудочном введении ДКВ. В обоих случаях оценку уровня ПОЛ осуществляли в гомогенатах печени животных.

Эксперименты invitro проводили в условиях индуцированного ПОЛ системой Fе 2+ -аскорбат. Результаты исследования ЛК рецептуры I представлены в табл. 1 и на рис.1. Добавление ЛК (без ДКВ) к гомогенату приводило к снижению концентрации МДА на 15 или 22% в зависимости от внесенного количества. Проявление антиокислительного действия самими липидами обусловлено содержащимися в них эндогенны­ми антиоксидантами, в частности, а-токоферолом. Проявляемый ЛК антиокислительный эффект далее учитывался в оценке действия ДКВ.

Таблица 1

Влияние кондитерской массы рецептуры на накопление МДА в гомогенате печени крыс.

Кол-во ДКВ от массы липидов Кол-во ДКВ (мкг/г) печени Концентрация МДА (мкМ/мг) белка АО-1 (%) АО-2 (%)
10 мг/г липидов, содержащихся в
инкубационной смеси
Контроль   329   0
ЛК без ДКВ   280   14.9
ЛК + 0.05% 10 -23+8* 8.1 21.9
ЛК + 0.2% 40 -52+9** 18.4 30.7
ЛК + 0.5% 100 -62+11** 23.4 33.7
ЛК + 1.0% 200 -74±6** 26.3 37.4
100 мг/г
Контроль   32S   0
ЛК без ДКВ   256   22.2
ЛК + 0.05% 100 -46±6** 18.1 36.2
ЛК + 0.2% 400 -65+9** 25.4 42.0
ЛК + 0.5% 1000 -101+10** 39.4 52.0
ЛК + 1.0% 2000 -87±15** 34.0 48.7

Примечание: АО-1 - антиоксидантный эффект по сравнению с ЛК без ДКВ; АО-2 - антиоксидантный эффект по сравнению с контролем. " - р<0.05 ** - р<0.01

ЛК, содержащие ДКВ, вызывали достоверное дозозависимое снижение скорости ПОЛ по сравнению как с контролем, так и с ЛК без ДКВ. При этом антиокислительный эффект усиливался с увеличением количе­ства ДКВ и достигал максимальных значений (53% и 49%) при концентрации 1000 мкг/г печени (100 мг ЛК с 0.5% ДКВ на 1 г печени) и 2000 мкг/г (100 мг ЛК с 1% ДКВ на 1 г печени).

Данные, полученные в результате исследования ЛК рецептуры II, приведены в табл. 2. В этом случае ЛК без ДКВ снижали скорость ПОЛ на 7% (10 мг/г) и 16.6% (100 мг/г) по сравнению с контролем. Меньшая антиоксидантная активность ЛК рецептуры II согласуется с ранее высказанным предположением о роли эндогенных антиоксидантов. В состав рецептуры II не входят жиросодержащие компоненты, являющиеся преимущественными носителями эндогенных антиоксидантов, например продукты какао бобов, которые составляют значительную часть рецептуры I.

Таблица 2

Влияние кондитерской массы рецептуры II на накопление МДА в гомогенате печени крыс.

Кол-во ДКВ, от массы липидов Кол-во ДКВ (мкг/г) печени Концентрация МДА, (мкМ/мг) белка АО-1 (%) АО-2 (%)
10 мг/г липидов, содержащихся в инкубационный смеси
Контроль ЛК без ДКВ   329   0
  363   7.3
ЛК +0.2% 40 -44±16* 12.0 18.7
ЛК + 0.5% 100 -45+13* 12.4 18.9
ЛК + 1 . 0% 200 -62±10** 17.0 23.3
100 мг/г
Контроль ЛК без ДКВ   392   0
  327   16.6
ЛК + 0.2% 400 -37±14* 11.4 26.1
ЛК + 0.5% 1000 -128±15** 39.2 49.3
ЛК + 1 . 0% 2000 -96*18** 29.4 «.,
         

Примечание: АС-1 - антиоксидантный эффект по сравнению с ЛК без ДКВ; АО-2 - антиоксидантный эффект по сравнению с контролем. * - р<0.05

** - р<0.01

Наличие ДКВ в ЛК рецептуры II достоверно усиливало антиокислительную актив­ность. При концентрации ДКВ в инкубационной смеси 400 мкг/г печени выраженность эффекта была максимальной (41% от контроля). Интересно, что такую же антиоксидантную активность при этой концентрации ДКВ проявляли ЛК рецептуры I.

Антиоксидантный эффект по сравнению с контролем. * - р<0.05 ** - р<0.01

Антиокислительная активность кондитерских изделий рецептуры I с различным содержанием ДКВ по отношению процессам ПОЛ в гомогенатах печени. 1 -липиды без ДКВ; 2 - липиды с 0.05% ДКВ; 3 - липиды с 0.2% ДКВ; 4 - липиды с 0.5% ДКВ; 5 - липиды с 1.0% ДКВ. О 10 мг/г печени; 100 мг/г печени.

Результаты экспериментов достоверно свидетельствуют о проявлении антиокислительного действия липидными фракциями, выделенными из кондитерских масс с до­бавкой ДКВ. Наибольший эффект, а именно 2-кратное замедление процессов ПОЛ, ока­зывали ЛК с 0.5 и 1.0% ДКВ.

С целью выявления влияния ЛК, содержащих ДКВ, на скорость ПОЛ в печени в условиях многократного перорального применения были проведены эксперименты на животных. В течение 7 дней мышам выводили ЛК в 200 мг/мышь (100 мг/кг в пересчете на ДКВ) на фоне дистрофического поражения печени четыреххлористым углеродом. В данном случае (в отличие от опытов invitro) индукция ПОЛ в печени осуществлялась прижизненно в результате поражения паренхимы печени сильным ядом ССI 4 , стимулирующим процессы свободнорадикального окисления. Поэтому для оценки уровня МДА в печени была использована методика определения спонтанного ПОЛ.

Объектами исследования служили ЛК, выделенные из кондитерских изделий рецептур I и II с 1.0% ДКВ от массы липидов.

Полученные результаты представлены в табл. 3 и обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента.

Поражение печени мышей в конце эксперимента четыреххлористым углеродом приводило к 3-кратному повышению скорости ПОЛ. Предварительное 7-дневное введение ЛК без ДКВ рецептуры I и рецептуры II предохраняло на 20.5 и 4.3%% соответственно клетки печени от усиления процессов пероксидации. Введение ЛК с 1.0% ДКВ приводило к заметному увеличению антиоксидантного эффекта (на 15 и 17%% соответственно по сравнению с контролем).

Таблица 3.

Проявление антиоксидантного эффекта рецептур I и II при 7-дневном введении мышам при поражении печени четыреххлористым углеродом.

Группа животных Кол-во ДКВ (мкг/кг) Концентра­ция МДА (мкМ/мг) белка АО-1 (%) АО-2 ( %)
Интактная   54±6    
Контроль   142±12   0
ЛК без ДКВ рецептуры I   113±5   20.5
ЛК+1.0% ДКВ рецептуры I 100 97 ±4 15 31.7
ЛК без ДКВ рецептуры II   136±10   4.3
ЛК+ 1.0% ДКВ рецептуры II 100 113±7 17 20.5

 

Примечание: АО-1 - антиоксидантный эффект по сравнению с ЛК без ДКВ; АО-2 - антиоксидантный эффект по сравнению с контролем.

На основании проведенной экспериментальной работы можно придти к заключению, что липидные фракции из кондитерских масс, содержащих ДКВ, обладают антиокислительной активностью, которая проявляется как в условиях опытов на биологической модели, так и при применении внутрь. Свободнорадикальные реакции тормозятся наиболее заметно при использовании кондитерских масс, содержащих 0.5-1.0% ДКВ. Существенных различий в этом плане между липидами из шоколадной (рецептура I) и конфетной (рецептура II) массами необнаружено. Это свидетельствует о том, что антиокислительное действие было обусловлено ДКВ независимо от состава кондитерской массы. Недавно было сообщено об ингибировании ССЦ-индуцированной микросомальной липидной пероксидации фенольными соединениями, в том числе и дигидрокверцетином.

Токсическое воздействие на печень мышей ССI 4 приводило к значительному усилению процессов ПОЛ, что сравнимо с ситуацией, наблюдаемой при отравлении различными ядами, при воздействии канцерогенных веществ, ионизирующей радиации, при развитии сердечно-сосудистой патологии и др. При многократном применении внутрь ЛК, содержащих ДКВ, выявлена отчетливая тенденция к замедлению ССI 4 -индуцированных свободнорадик-альных реакций в печени животных. Следовательно, кондитерские изделия с ДКВ могут служить источником недостающих живому организму антиоксидантов. Это обстоятельство имеет большое значение для обоснования возможности использования кондитерских изделий с добавкой ДКВ вкачестве лечебно-профилактических средств

Экспериментальная часть

Опыты invitro. Проводили с использованием гомогената печени 30 белых беспородных крыс обоего пола массой 200-250 г. Животных забивали декапитацией, извлекали печень, промывали физиологическим раствором и готовили навески по 0.5 г для гомогенизации. За сутки до забоя животные питания не получали.

Опыты invivo. Проводили на 60 белых беспородных мышах весом 20-22 г.

Животные были разделены на 6 групп по 10 мышей в каждой:

- 1-й группе (интактная группа) внутри-желудочно вводили водопроводную воду в объеме 0.2 мл и не подвергали действию ССI 4 ;

- 2-й группе (контроль на ЛК без ДКВ) вводили воду и в конце эксперимента ССI 4

- 3-й группе (контроль на ДКВ) вводили в расплавленном виде 200 мг ЛК без ДКВ рецептуры I;

- 4-й группе (опытная) вводили ЛК рецептуры I с 1.0% ДКВ;

- 5-й группе (контроль на ДКВ) вводили ЛК рецептуры II без ДКВ;

- 6-й группе (опытная) вводили ЛК рецептуры II с 1.0% ДКВ.

Испытуемые пробы вводили натощак ежедневно в течение 7 дней. На 7-й день эксперимента, через 30 мин после последнего введения испытуемой пробы, подкожно вводили ССЦ (в виде 50% масляного раствора) из расчета 0.08 мл/мышь, что быстро приводило к развитию дистрофических процессов в печени. Через 3 ч после поражения печени животных забивали и печень забирали для гомогенизации.

Определение МДА при спонтанном ПОЛ. 0.5 г печени гомогенизировали с 5 мл трис-HCI буфера (рН 7.4). Получившуюся инкубационную смесь разливали по 2 мл в пробирки и инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Реакцию останавливали путем добавления 2 мл 30% раствора трихлорук-сусной кислоты. Затем в каждую пробирку приливали по 0.2 мл 5 М HCI и 2 мл 0.8% водного раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и смесь нагревали на горячей (85-90°С) водяной бане 20 мин, охлаждали и центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. Оптическую плотность измеряли при длине волны 535 нм. Концентра­цию МДА рассчитывали, исходя из молярного коэффициента экстинкции (е) пигмента, образованного МДА с ТБК, равного 1.56х10 5 М -1. см -1 , в нМ/г белка или мкМ/мг.

Определение МДА при индуцированном ПОЛ. 0.5 г печени гомогенизировали с 5 мл трис-HCI буфера (рН 7.4), содержащего FeSO 4 6H 2 O (6.6 мг/100 мл) и аскорбиновую кислоту (14 мг/100 мл). Дальнейшая последовательность работ с инкубационной смесь аналогична методике определения спонтанного ПОЛ.

ЛК, в виде растопленной массы, добавляли к навеске печени непосредственно перед гомогенизацией в количестве 10 или 100 мг на 1 г печени, что соответствовало концентрации ДКВ от 10 до 2000 мкг/г пе­чени в зависимости от исходного процентного содержания.

Контролем служили исходные гомогенаты печени и гомогенаты печени с добавленной липидной фракцией без ДКВ в количестве 10 или 100 мг/г печени.

Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием разностного метода в сравнении опытных данных с контрольными.

Выводы

1. Установлено, что липидные фракции кондитерских масс, содержащие ДКВ от 0.05 до 1 .0%, проявляют антиокислительную активность в условиях Fе 2+ -аскорбат-индуцированного ПОЛ в гомогенате печени крыс. Наибольшую активность проявляют кондитерские массы рецептур I и II с 0.5 и 1 .0% ДКВ. Под их влиянием процессы ПОЛ в печени замедляются примерно в 2 раза.

2. Показано, что при профилактическом введении внутрь в течение 7 дней липидов кондитерских изделий с 1.0% ДКВ существенно предохраняется печень животных (мышей) от усиления процессов ПОЛ под влиянием ССI 4 .

3. На основании проведенных экспериментов можно рекомендовать использование кондитерских масс рецептур I и II с 0.5 и 1.0% ДКВ с лечебно-профилактическими целями в условиях повышенного риска усиления ПОЛ.