Ведущее место в анализе пищевых антиоксидантов в последнее время занимает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Целью настоящего исследования была разработка методики ВЭЖХ определения дигидрокверцетина (ДКВ), добавленного в качестве антиоксиданта к кондитерским изделиям. По отношению к ДКВ метод ВЭЖХ был использован при анализе его в лекарственном препарате и в биожидкостях (моче, плазме крови).

Прямое перенесение известных методик на кондитерские массы не представляется возможным из-за специфики в химическом составе объектов. Основное внимание при создании методики было уделено подбору условий подготовки проб к хроматографическому анализу, с помощью которых достигалось не только наиболее полное выде­ление ДКВ из кондитерской массы, но и освобождение его от сопутствующих и ме­шающих анализу веществ.

Подготовленная к вводу в хроматограф испытуемая проба не должна содержать жиры, углеводы и белки. По принятой в нашей работе схеме, приведенной на рис. 1, измельченную кондитерскую массу сначала экстрагируют неполярным растворителем (петролейный эфир, гексан и т.п.) до полного удаления жиров, ДКВ при этом не экстрагируется. Затем из обезжиренной кондитерской массы извлекают ДКВ полярным растворителем - ацетонитрилом - и попутно некоторые другие органические соединения (a-токоферол, теобромин и др.). Углеводы и белки в ацетонитриле не растворяются, что обеспечивает освобождение от них испытуемой пробы. Отцентрифугированная надосадочная жидкость (супернатант) может вводиться в хроматограф.

В результате апробирования ряда сорбентов и подвижных фаз оптимальными были признаны условия хроматографирования на обращенно-фазном сорбенте Lichrosorb 10 RP-2 с подвижной фазой аце-тонитрил-2% уксусная кислота (3:7, об.). Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора в максимуме поглощения ДКВ при длине волны 290 нм. Типичная хроматограмма представлена на рис. 2.

Отнесение пика, принадлежащего ДКВ, производили путем сравнения со временем выхода пика стандартного образца (СО) ДКВ и путем кохроматографии, заключающейся в том, что к ацетонитрильному экстракту добавляли известное количество СО ДКВ и отмечали у какого из пиков про­изойдет увеличение площади. Установлено, что в описанных хроматог-рафических условиях СО ДКВ имеет время удержания (ВУ) 5.83 мин. На хроматограм-ме ацетонитрильного экстракта имеется пик с таким же ВУ и именно площадь этого пика возрастает при добавлении СО ДКВ к ацетонитрильному экстракту. Следовательно, пик 3 на хроматограмме соответствует ДКВ.

Какао тертое и какао порошок являются "поставщиками" в ацетонитрильный экстракт теобромина, соответствующего пику 1 с ВУ 3.38 мин, и ?-токоферола, соответствующего пику 2 с ВУ 3.85 мин.

Величина навески кондитерской массы должна быть такой, чтобы у образцов с низким содержанием ДКВ площадь его пика на хромаюграмме была в пределах достоверности, а у образцов с высоким содержанием ДКВ не происходило перегрузки колонки и ''зашкаливания" пика. Опытным путем было установлено, что оптимальной является навеска, равная 100 мг.

Метрологические характеристики методики представлены в таблице. Относительная ошибка определения при уровне вероятности 0.95 равна ±7.8%.

Разработанная методика была использована в количественном анализе ДКВ в составе сахаристых кондитерских масс на жировой основе. По мере увеличения продолжительности хранения кондитерских масс содержание ДКВ за первый месяц хранения уменьшается на 10-15% от исходного, затем темп снижения замедляется и не возрастает более 20-25% даже к концу 8-месячного периода хранения. Содержание а-токоферо-ла при этом резко снижается через 1 мес хранения, а в образцах после 1.5-2 мес. хранения он уже не обнаруживался совсем. Этот факт служит экспериментальным доказательством того, что ДКВ обладает боль­шей стабильностью по сравнению с а-токо-феролом.

Хроматограмма ВЭЖХ ацетонитрильного экстракта кондитерской массы, изготовленной с добавкой ДКВ (условия хроматографирования приведены в экспериментальной части). 1 - теобромин (ВУ 3.38 мин); 2 - ?-токоферол (ВУ 3.85 мин); 3 -ДКВ (ВУ 5.83 мин).

Экспериментальная часть

Подготовка пробы кондитерской массы к анализу. 100 мг (точная навеска) измельченной кондитерской массы помещали в пробирку с притертой пробкой, прибавляли микропипеткой 1 мл гексана (или петролейного эфира) и 1 мл ацетонитрила, закрывали пробкой и интенсивно встряхивали в течение 1 мин.

Полученную взвесь переносили в цент-рифужную пробирку и центрифугировали в течение 5 мин при 11500 об/мин. Микропипеткой отбирали 0.7 мл ацетонитрильного слоя и переносили в другую центрифужную пробирку. После центрифугирования при 11500 об/мин в течение 3 мин отбирали пробу 20 мкл и вводили в хроматограф.

Условия хроматографирования. Анализ проводили на жидкостном хроматографе Spectra-Physics 8700 с Уф-детектором SP-8400, колонка 25x4.6 мм, сорбент Lichrosorb 10 RP-2, подвижная фаза ацетонитрил-2% уксусная кислота (3:7, об.) при скорости по­тока 1 мл/мин. Аналитическая длина волны 290 нм.

Содержание ДКВ в анализируемой пробе рассчитывали с использованием метода внешнего стандарта (СО ДКВ).

Выводы

1. Разработана методика пробоподготов-ки сахаристых кондитерских изделий на жи­ровой основе к анализу ДКВ методом ВЭЖХ, заключающаяся в обработке кондитерской массы неполярным (гексан, петро-лейный эфир) и полярным (ацетонитрил) органическим растворителями с целью отделе­ния ДКВ и освобождения от липидной и углеводной фракций.

2. Разработана методика ВЭЖХ количественного анализа ДКВ в кондитерских массах, которая может быть использована для контроля качества кондитерских масс и лечебно-профилактических кондитерских изделий, изготовленных с добавкой ДКВ.

3. Показано, что в процессе хранения кондитерских масс количество ДКВ за первый месяц снижается на 10-15% и за период 8 мес хранения - на 20-25%.

4. Методом ВЭЖХ показано, что ДКВ обладает высокой стабильностью по сравнению с эндогенным антиоксидантом - ?-токо-феролом, который практически полностью разлагается после 1 месяца хранения кондитерских масс.