А. П. Еськин, В. А. Левданский, Н. И. Полежаева
Институт химии и химической технологии СО РАН, Красноярск

Разработан метод количественного фотометрического определения дигидрокверцетина. Метод позволяет определять дигидрокверцетин в смеси с другими соединениями без выделения его в чистом виде. Сущность метода состоит в переводе бесцветного дигидрокверцетина в окрашенное соединение и измерении интенсивности окраски полученного раствора. Предложенным методом определено содержание дигидрокверцетина в образцах древесины лиственницы сибирской.

Введение

Дигидрокверцетин (3,3,4,5,7-пентагидрокси-флаванон) является ценным биологически активным веществом: применяется в качестве антиоксиданта жиров и растительных масел, служит лекарственным препаратом. Так, дигидрокверцетин (ДКВ) используется для защиты сухого молока от процессов свободнорадикального окисления, а также в качестве антиоксидантной пищевой добавки. Диквертин – медицинский препарат на основе ДКВ, обладает антиоксидантными свойствами, капилляропротекторной, противоотечной и радиопротекторной активностью, оказывает гепатопротекторное (антитоксичное) действие.

При сульфитной варке древесины ДКВ, взаимодействуя с бисульфит-ионами, оказывает отрицательное влияние на стабильность сульфитной кислоты.

Существующие методики количественного определения ДКВ требуют, как правило, предварительного его выделения в чистом виде. Например, с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии, с предварительным разделением тонкослойной хроматографией на капроновом порошке и последующим элюированием. Определение ДКВ с помощью газожидкостной хроматографии требует дорогостоящего оборудования.

Выделение индивидуальных веществ из сложной смеси – процесс достаточно трудоемкий и продолжителен во времени. Кроме того, в процессе выделения неизбежны потери, а это в свою очередь сказывается на точности определения.

В связи с этим проблема аналитического определения ДКВ в смеси с другими соединениями без его выделения в чистом виде остается актуальной.

Экспериментальная часть

Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3 при 550 нм. Калибровочный график сстроили для стандартных растворов ДКВ, который был выделен из препарата “Диквертин”. Исходный раствор ДКВ в этаноле готовили в пикнометре на 25 мл. Разбавлением исходных растворов получали растворы с пониженной концентрацией. Спектр поглощения реакционной массы в видимой области снят на приборе “UV-30 Shimadzu”. Ацетон и цинковая пыль были квалификации ч.д.а., соляная кислота и уксусная кислота – о.с.ч.

Обсуждение результатов

Сущность колориметрических определений состоит в следующем: определяемый компонент при помощи химической реакции переводят в окрашенное соединение, после чего измеряют интенсивность окраски полученного раствора. Таким образом, при колориметрическом определении существенное значение имеют, с одной стороны, правильно выбранные условия выполнения химической реакции по переведению определяемого компонента в окрашенный раствор и, с другой стороны, знание оптических свойств окрашенных растворов, и на этом основании – умение правильно выбрать способ измерения интенсивности окраски.

Основанием для разработки такого метода послужила реакция образования цианидинхлорида из дигидрокверцетина при обработке последнего цинковой пылью в присутствии соляной кислоты.

Вероятный механизм реакции включает в себя кислотнокатализируемую енолизацию или кислотный сдвиг от С(3) к С(4) с образованием псевдооснования антоцианидина и последующим образованием цианидинхлорида в кислотном растворе.

Время жизни цианидинхлорида в фотометрируемом растворе ограничено. Cледовательно, важно было подобрать такие условия реакции, при которых образование цианидинхлорида протекало бы более полно с удовлетворительной скоростью, и в то же время временной фактор был бы менее критичным.

В работе описан способ определения ДВК в водных экстрактах дугласовой пихты с помощью двухстадийного процесса. Этот процесс мягкого восстановления ДКВ требует 30–40 мин. кипячения водного экстракта в растворе ацетона с уксусной кислотой и цинковой пылью. Затем, после удаления избытка цинковой пыли и добавлении соляной кислоты, раствор фотометрировался.

При восстановлении этанольного раствора ДКВ в ацетоне концентрированной соляной кислотой и цинковой пылью время жизни цианидинхлорида ограничено и, кроме того, мала чувствительность реакции. Восстановление этанольного раствора ДКВ в ацетоне 10 % соляной кислотой приводит к появлению окраски только через 70 мин. Следует предположить, что, сочетая жесткое и мягкое восстановление ДКВ, можно добиться оптимальных условий протекания реакции по времени и чувствительности.

Нами предложено использовать смесь, состоящую из концентрированной соляной кислоты, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 3:3:1 (об.  %). На рис. 1 приведен спектр поглощения реакционной смеси в видимой области. Исходя из спектра поглощения нами была выбрана аналитическая длина волны (? = 550 нм).

На рис. 2 приведена зависимость скорости образования окрашенного продукта от времени из которго видно, что предложенную нами систему можно позволяет использовать для определения ДКВ. Восстановление ДКВ 10 % соляной кислотой хотя и приводит к устойчивому образованию окраски, но для этого требуется продолжительное время (70–80 мин).

В качестве растворителей, применяемых нами для восстановления ДКВ, были использованы этанол и ацетон. Показано, что при проведении реакции в ацетоне чувствительность реакции более высокая, чем в этаноле, что, по-видимому, объясняется температурой условиями кипения реакционной смеси (70 ? 0.1°С в термостате).

Масса цинковой пыли (0.2 г), используемой для восстановления, была выбрана исходя из достаточного её количества для восстановления ДКВ и существенно не влияет на образование окрашенного продукта.

Продолжительность нагревания варьировалась от 10 до 40 сек. В табл. 1 приведена

зависимость оптической плотности от продолжительности нагревания раствора.

Закон Бера выполняется в пределах концентраций ДКВ (2.46–16.38)?10-5 моль/л с помощью метода наименьших квадратов были найдены коэффициенты в уравнении.

Для подтверждения достоверности данных предложенного метода было осуществлено определение ДКВ в стандартных растворах с помощью нашего и двухстадийного метода описанного в работе. Результаты определения приведены в табл. 2, 3.

Таблица 1

Зависимость оптической плотности (?=550 нм) от времени нагревания раствора, (концентрация ДКВ –4.49?10 -5 моль/л)

Время нагревания, с 10 20 30 40
Оптическая плотность раствора, 0.282 0.285 0.217 0.165

 

Оптимальное время восстановления ДКВ – 20 сек.

Таблица 2

Результаты определения ДКВ предложенным методом (концентрация ДКВ – 6.17?10-5 моль/л)

Концентрация дигидрокверцетина 6.17 6.13 6.19 6.16 6.18
Отклонение от среднего 0 0.04 0.02 0.02 0.01

 

Стандартное отклонение 0.0235.

Таблица 3

Результаты определения ДКВ двухстадийным методом* (концентрация ДКВ – 6.17?10-5 моль/л)

Концентрация дигидрокверцетина 5.26 5.25 5.23 5.24 5.21
Отклонение от среднего 0.02 0.01 0.01 0 0.03

 

Из табличных данных можно сделать вывод о том, что предложенный нами метод определения ДКВ имеет более высокую чувствительность чем описанный в аботе, а продолжительность анализа, на порядок меньше.

По разработанной методике была определена концентрация ДКВ в спиртовых экстрактах лиственницы сибирской (табл. 4). Содержание ДКВ в исследуемых нами образцах древесины составляет 1.53 %.

Таблица 4

Дигидрокверцетин в  % 1.56 1.55 1.50 1.53 1.53
Отклонение от среднего 0.03 0.02 0.03 0 0

 

Стандартное отклонение 0.0235.

Следует отметить, что содержащиеся в древесине лиственницы сибирской кверцетин и кемферол в данных условиях не образуют окрашенных продуктов, а аромадендрин, способный образовывать окрашенные продукты, содержится в этой древесине в следовых количествах.

Методика определения ДКВ в древесине

3.0088 г измельченных опилок лиственницы сибирской (1–2 мм) с влажностью 5.85 % кипятили в круглодонной колбе с обратным холодильником 1 час в 80 мл этанола. После отделения опилок последние промывали на фильтре 15 мл этанола. Экстракт разбавляли в мерной колбе до 100 мл. 1 мл экстракта помещали в пробирку, содержащую 0.2 г. цинковой пыли и 2 мл ацетона. После внесения 1 мл смеси, состоящей из соляной кислоты (? = 1.19), ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 3:3:1 (по объему), пробирку встряхивали и нагревали в термостате (70 ? 0.1°С) в течение 20 сек. Пробирку охлаждали ледяной водой 20 сек, раствор декантировали в мерную колбу на 25 мл. Остаток цинковой пыли промывали дважды ацетоном по 5 мл. Доводили до метки ацетоном и через 5 минут после окончания нагревания определяли оптическую плотность. Раствор сравнения готовили таким же образом, но вместо спиртового экстракта древесины вливали 1 мл этанола.

Определение ДКВ с помощью двухстадийного процесса осуществляли по методике, описанной в работе.

Заключение

Разработан быстрый метод количественного фотометрического определения дигидрокверцетина в смесях с другими соединениями без выделения его в чистом виде. Рекомендуемый диапазон определяемых концентраций (2.46 – 16.38)?10 -5 моль/л дигидрокверцетина. Предложенным методом определено содержание дигидрокверцетина в образцах древесины лиственницы сибирской. Показано преимущество метода по сравнению с описанным в литературе.