Липиды пищевых продуктов при технологической обработке и хранении подверга­ются свободнорадикальному окислению (СРО), что приводит к снижению качества и питательной ценности продуктов. Для защиты их от процесса СРО используют добавки антиоксидантов, среди которых предпочтение отдается радикальным ингибиторам природного происхождения (аскорбат, ?-то-коферол, ?-каротин и др.)- К этой группе антиоксидантов относятся некоторые биофлавоноиды, например, дигидрокверцетин (ДКВ). Известно, что использование ДКВ в качестве антиоксиданта применительно к сухому молоку способствует защите липидов молока от пероксидного окисления.

 Цель настоящего исследования состояла в углубленном изучении ингибирующего дейст­вия ДКВ по отношению к СРО липидов сухо­го молока, изготовленного с добавкой ДКВ.

Материалы и методы. Объектами иссле­дования служили образцы сухого молока, выработанные на Калининском молочнокон-сервном комбинате (Саратовская область) по способу [5] с добавкой 0.02%, 0.08% или 0.2% ДКВ от массы липидов. Пробы для анализа готовили путем добавления 1.0 г сухого молока 10.0 мл фосфатного буфера (40 мМ КН2РО4, 100 мМ KCI, рН 7.5), полученную эмульсию инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Хемилюминесценцию (ХЛ) индуцировали с помощью ионов Fe2+ [6]. Для этого к 0.5 мл эмульсии добавляли 0.2 мл люминола (2 мМ) и доводили общий объем реакционной смеси до 4.5 мл с помощью фосфат­ного буфера. Процесс СРО липидов молока инициировали введением 0.2 мл свежеприготовленного 25 мМ водного раствора суль­фата железа. ХЛ, сопровождающую процесс липидной пероксидации молока, регистрировали в течение 10 мин.

Накопление продуктов липидной пероксидации через 10 мин после введения сульфата железа оценивали по тесту с тиобар-битуровой кислотой.

Обсуждение результатов

Обнаружено, что введение сульфата железа в образец молока, изготовленного без добавления ДКВ, индуцирует развитие ХЛ. Поскольку интенсивность регистрируемого свечения была невысокой (рис.1, кривая 1), то по этой причине в систему вводился активатор ХЛ - люминол. В присутствии люминола ХЛ липидов молока значительно усиливалась и носила двухфазный характер (рис. 1, кривая 2). Сразу после введения сульфата железа наблюдалась "быстрая" фаза свечения, которая длилась несколько секунд. Вслед за "быстрой" следовала более "медленная" фаза, максимальная интенсивность ХЛ которой достигалась примерно через 3-4 мин после добав­ления сульфата железа. Максимальная интенсивность "медленной" фазы свечения служила в качестве основного определяемого параметра.

Как видно из рис. 2, добавление ионов Fe2+, к анализируемым образцам приводило не только к развитию люминол-зависимой ХЛ, но и к накоплению продуктов СРО липидов молока, одним из которых является малоновый диальдегид (МДА). В отсутствие ионов Fe2+ МДА в молочных эмульсиях практически не обнаруживался.

При исследовании образцов сухого молока, изготовленных с добавлением 0.02, 0.08 или 0.2% ДКВ от массы липидов, выявлено дозозависимое снижение как интенсивности ХЛ, так и накопления МДА. Например, при содержании ДКВ 0.2% интенсив­ность ХЛ и накопление МДА составили около 10% по сравнению с контролем- (рис. 3). На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что, во-первых, ДКВ эф­фективно защищает липиды молока от Fе2+-индуцированной пероксидации и, во-вторых, что ХЛ-тест и МДА-тест несут одно­типную информацию об уровне процесса СРО молочных липидов.

Типичные кинетики Fе2+ - индуцированной хемилюминесценции молока (стрелкой отмечен момент введения сульфата железа).

1 - без люминола; 2-c люминолом.

По оси абсцисс - время, мин. По оси ординат - интенсивность ХЛ, отн. ед.

Накопление малонового диальдегида в процессе свободнорадикального окисления молока. 1 - в отсутствии сульфата железа; 2 - в присутствии сульфата железа. По оси ординат - количество МДА в реакционной смеси, нмоль/мл.

Влияние дигидрокверцетина на интенсивность хемилюминесценции и накопление МДА при Fе2+-индуцированном окислении липидов молока. 1 - контроль (без ДКВ); 2 - 0.02% ДКВ; 3 - 0.08% ДКВ; 4 -0.2% ДКВ. По оси ординат - интенсивность ХЛ и количество МДА, % по отношению к контролю.

Изменение интенсивности хеми­люминесценции липидов молока с различ­ным содержанием Дигидрокверцетина в процессе хранения. 1 - контроль (без ДКВ); 2 - 0.02% ДКВ; 3 - 0.08% ДКВ; 4 - 0.2% ДКВ.

По оси абсцисс - срок хранения молока, мес. По оси ординат - интенсивность ХЛ, отн. ед.

С практической точки зрения представляло интерес оценить способность ДКВ тормозить автоокисление липидов сухого молока в период его длительного хранения. Эксперимент был проведен на сухом молоке, хранящемся в течение 8 месяцев при температуре 20±2°С. Пробы анализировали с определенной периодичностью (О, 3, 6 и 8 , месяцев) и регистрировали интенсивность Fе2+-индуцированной ХЛ в присутствии люминола. Обнаружено, что интенсивность Fе2+-индуцированного свечения молока без антиоксиданта ДКВ незначительно увеличивалась в течение первых 6 месяцев хранения, повышаясь в 1.7 раза по сравнению с исходным уровнем к 8 месяцам хранения (рис. 4). У образцов с ДКВ интенсивность ХЛ в процессе изменялась аналогичным образом, однако была существенно ниже, чем у соответствующих образцов молока, изготовленных без добавления ДКВ. При этом наибольшее ингибирование люминол-зависимой Fе2+-индуцированной ХЛ молока наблюдалась при содержании ДКВ 0.08% и 0.2% от массы липидов. Например, через 6 месяцев хранения интенсивность ХЛ у об­разца с 0.2% ДКВ была в 4 раза ниже по сравнению с контрольным образцом, а через 8 месяцев - ниже в 2.6 раза.

Возможный путь генерации квантов Fе2+-индуцированной хемилюминесценции молока в присутствии люминола.

RH - липиды молока; R, RO, RO2 -липидные радикалы; ROOH - липидные гидропероксиды; LH- -люминол; L- - ради­кал люминола; LO22 - эндопероксид люминола; АР2- - 3-аминофталат-анион.

Исходя из результатов, полученных при хранении сухого молока, можно предполо­жить гипотетическую схему антиоксидантного действия ДКВ, представленную на рис. 5. Как видно из этой схемы, хранение сухого молока сопровождается его автоокислением, в процессе которого происходит постепенное накопление липидных гидропероксидов ROOH. Добавление ионов Fе2+ приводит к разрушению гидропероксидов (реакция вырожденного разветвления цепи) с образованием соответствующих радикальных продуктов RO. Взаимодействие RO с люминолом LH- дает начало цепи взаимодействий, в результате которых происходит генерация квантов света. Ингибирование интенсивности Fе2+-индуцированного свечения введенным в молоко ДКВ может быть результатом, во-первых, уменьшения накопления гидропе-роксидов ROOH вследствие взаимодействия ДКВ с липидными радикалами (R, RO, RO2), образующимися в процессе автоокисления молока; во-вторых, перехвата R, RO и RO2, генерируемых при Fе2+-индуцированном окислении; в-третьих, перехвата супероксидных анион-радикалов, O2 и радикалов люминола L-. Однако, учитывая, что ДКВ является жирорастворимым антиоксидантом, его взаимодействие с липидными радикалами и супероксидным анион-радикалом представляется более вероятным, чем с водорастворимыми радикалами люминола.

Выводы

  1. С помощью хемилюминесцентного метода показано, что ДКВ проявляет инги-бирующее действие по отношению к про­цессу свободнорадикального окисления липидов сухого молока. В целом, интенсивность Fе2+-зависимой ХЛ липидов молока снижается под воздействием ДКВ в 2-10 раз в зависимости от количества добавленного антиоксиданта ДКВ.
  2. Показано, что добавка ДКВ положительно сказывается на снижении количества накапливаемых в сухом молоке продуктов окисления. Особенно это проявляется в условиях длительного хранения: через 8 месяцев хранения количество МДА в сухом молоке с 0.2% ДКВ было на 90% меньше, чем в контрольном образце.
  3. Предложен и обсужден механизм антиоксидантного действия ДКВ по отноше­нию к процессу автоокисления липидов молока, состоящий во взаимодействии ДКВ с липидными радикалами R-, RO', RO2' и супероксидным радикалом О2-.